Chemicall根癌(热激)感受态细胞

GV3101 Chemically Competent Cell  根癌(热激)感受态细胞

基因型：

C58 (rif R) Ti pMP90 (pTiC58DT-DNA) ( gentR) Nopaline

简要说明：

GV3101菌株为C58型背景，核基因中含有筛选标签——LI福平抗性基因rif，为了便于转化操作，此菌株携带一无自身转运功能的胭脂碱型Ti质粒pMP90 (pTiC58DT-DNA)，此质粒含有vir基因（vir基因是T-DNA插入植物基因组必需的元件，pMP90(pTiC58DT-DNA)质粒自身的T-DNA转移功能被破坏，但可以帮助转入的双元载体T-DNA顺利转移）。pMP90 (pTiC58DT-DNA)型Ti 质粒含有筛选标签：gent，赋予GV3101菌株QING大霉素抗性，适用于拟南芥、烟草、玉米、土豆等植物的转基因操作， GV3101化转感受态经特殊工艺制作，经pCAMBIA2301质粒检测转化效率可达104cfu/μg。

操作说明：

1.取-80℃保存的农杆菌感受态于冰上待其部分融化，处于冰水混合状态时插入冰中。 

2.每100μl感受态加1ug（体积不大于10ul）质粒DNA，用手bo打管底混匀，依次于冰上静置5分钟、液氮5分钟、28℃水浴5分钟、冰浴5分钟。 

3.加入700μl无抗生素的LB或YEB液体培养基，于28℃振荡培养2~3小时。 

4.6000rpm离心一分钟收菌，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天（当平板只含有50ug/ml kan 时，28℃培养48h即可；平板中同时加入50ug/ml kan，20ug/ml rif 时，需28℃培养60h；如果使用的平板含有50ug/ml rif 则需要28℃培养72-90h）。

注意事项：

1.加入质粒时体积不应大于感受态体积的1/10 ；质粒不纯或存在乙醇等有机物污染，转化效率急剧下降；质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。 

2.混入质粒时应轻柔操作。 

3.转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。 

4.LI福平浓度不应高于25ug/ul，过高的LI福平浓度不利于农杆菌生长，会降低其生长速度和转化效率。本公司感受态计算转化效率时所用平板只含有50ug/ml kan，若所用平板含有20ug/ml rif则转化效率降低到1/2。 

5.培养基中加入LI福平的目的是防止杂菌生长、筛选农杆菌；根据所用菌株抗性加入LIAN霉素或QING大霉素可防止Ti质粒丢失，但LIAN霉素不利于农杆菌的转基因操作，所以一般培养农杆菌时不考虑LIAN霉素或QING大霉素，Ti质粒丢失的概率极低（可以忽略）。