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Cassification
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详细介绍
品牌 | Abnbio | 货号 | ABD304-20 |
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规格 | 20支50ul | 供货周期 | 现货 |
主要用途 | 细胞培养 | 应用领域 | 化工,生物产业,制药 |
DB3.1 Electroporation-Competent Cell 克隆 (电击) 感受态细胞
基因型:
F- gyrA462 endA1 glnV44 (sr1-recA)mcrBmrr hsdS20(rB-,mB-)ara14galK2lacY1proA2rpsL20(Smr) xyl5 Δleu mtl1
简要说明:
DB3.1大肠杆菌菌株基因组中含有gyrA462基因,赋予其对ccdB毒性基因的抗性,特别适用于构建或扩繁含有ccdB基因的质粒载体(例GATEWAY System vector) ,此菌株具有连、霉素抗性。 High5TM系列DB3.1电击感受态细胞经特殊工艺制作,经pUC19检测转化效率>1010 cfu/μg DNA。
操作说明:
一、0.1cm 电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上 5分钟,待其沥干水分,正置 5分钟,使乙醇充分挥发,待乙醇挥发干净立即插入冰中,压实冰面,电极杯顶离冰面 0.5cm以方便盖上杯盖,冰中静置 5分钟充分降温。
二、取-80℃保存的TOP-10电击感受态细胞插入冰中5 分钟,待其融化,加入目的 DNA (质粒或连接产物)并用手bo打EP 管底轻轻混匀,避免产生气泡,立即插入冰中。A. 测定转化效率使用 1 μl 10 pg/μl 的对照质粒 pUC19; B. 对于连接产物,请用乙醇沉淀DNA 后加入适量 TE缓冲液(10mM TrisHCl, pH7.5;1mM EDTA)重悬,DNA 浓度不超过100ng/μl,体积不超过 5μl/50μl 感受态。
三、用200 μl枪头将感受态-DNA 混合物快速移到电击杯中,避免产生气泡,盖上杯盖。
四、启动电转仪,设置参数:C=25 μF,PC=200 Ω,V=1.8kV(此为 BioRad 电转仪推荐参数,也可按所用电转仪推荐的参数操作),将电击杯快速放入电转槽中,电击完成快速插入冰中。
五、2分钟后从冰中取出电击杯,放室温,加入 700 μl不含抗生素的无菌 S.O.C. 培养基(室温),用1ml 枪吹吸电击杯底部数次混匀后,转移到 50ml 离心管(BD Falcon50ml锥形离心管等),向离心管中补加S.O.C. 培养基至 5ml。37℃,225rpm 复苏60 分钟。
六、5000rpm离心一分钟收菌,重悬后取 100-200 μl涂布到含相应抗生素的S.O.C 平板上(因菌量较大,若全部涂板请选用直径 15cm培养皿2-5 个)。将平板倒置放于 37℃培养箱过夜培养13-17 小时。
注意事项:
(一)加入DNA 时体积不应大于感受态体积的1/10。
(二)电击感受态细胞加入电击杯应避免产生气泡,气泡会增加弧光放电风险。
(三)当DNA 不纯或存在盐,乙醇,蛋白及缓冲液等污染时,转化效率急剧下降。
(四)电击杯里的离子可增加溶液的电导,增大在含有细胞和DNA 的溶液中产生电流和弧光放电的风险。
(五)若转化大质粒或想获得较高转化效率,推荐使用高纯质粒提取试剂盒提取质粒。质粒增大一倍,转化效率下降一个数量级。
(六)对于连接产物转化, 最好转化前乙醇沉淀DNA后用适量TE缓冲液 (10 mMTrisHCl,pH7.5;1 mMEDTA)重悬产物,保证DNA 浓度不超过 100ng/μl。过高浓度连接产物或过大体积连接产物会降低转化效率,增加弧光放电的风险。
(七)混入质粒时应轻柔操作,吸取感受态细胞时不可用孔径过小的枪头 (普通 200ul 枪头应剪去枪头尖0.6cm)避免用力过猛,以免剪切力过大损伤细胞膜,降低转化效率。转化高浓度的质粒或连接产物可相应减少最终用于涂板的菌量。
(八)电击感受态细胞最好保存在-80℃以下,高于-80℃超期储存会导致转化效率会下降。
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