Chemically Competent Cell克隆感受态细胞

BJ5183 Chemically Competent Cell

基因型：

endA1 sbcBC recBC galK met thi-1 bioT hsdR (StrR)

简要说明：

BJ5183是一种具有较高重组活力的大肠杆菌菌株，是目前腺病毒系统常用的感受态细胞。BJ5183菌株含有sbcBC recBC双重突变，赋予BJ5183细胞较强的重组能力，有利于转入的目的基因与腺病毒质粒{pAdeasy-1[encodes the Adenovirus-5genome (E1/E3 deleted)]或pAdeasy-2[encodes theAdenovirus-5 genome (E1/E3/E4 deleted)]}的重组。endA1（缺失核酸内切酶）的突变有利于重组DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。StrR赋予BJ5183菌株lian霉素抗性。BJ5183感受态细胞经特殊工艺制作，pUC19质粒检测转化效率>5×108 cfu/μgDNA。

操作说明：

1.BJ5183感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，待菌块融化，加入目的质粒（含有目标基因并线性化）和腺病毒质粒，并用手bo打EP管底轻轻混匀(避免用枪吸打)，冰中静置25分钟。 

2.42℃水浴热激45秒，迅速放回冰中并静置2分钟，晃动会降低转化效率。 

3.向离心管中加入700 μl不含抗生素的2YT或LB无菌培养基，混匀后37℃，200 rpm复苏60分钟。 

4.5000 rpm离心一分钟收菌，留取100 μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的2YT或LB培养基上。 

5.将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。

注意事项：

1.感受态细胞最好在冰中缓慢融化，插入冰中8分钟内加入目标DNA，不可在冰中放置时间过长，长时间存放会降低转化效率。 

2.混入目的DNA时应轻柔操作。 

3.BJ5183菌株的质粒产量不高。腺病毒构建成功后，可选择在其他大肠杆菌菌株中扩繁，纯化质粒。 

4.BJ5183感受态细胞对温度敏感，应储存在-80℃超低温冰箱，避免温度波动，温度波动会降低感受态转化效率。