Chemically Competent Cell克隆感受态细胞

DH10Bac Chemically Competent Cell

基因型：

F- mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC) 80lacZM15 lacX74 recA1 endA1araD139 ∆(ara,leu)7697 galU galK λ- rpsL nupG/pMON14272 / pMON7124

简要说明：

DH10Bac感受态主要用于生产重组杆状病毒分子（Bac-to-Bac杆状病毒表达系统）。DH10Bac菌株中含有父本杆粒bMON14272、辅助质粒pMON7124：父本杆粒 bMON14272包含mini-F复制子,卡那抗性基因, attTn7位点和lacZα互补因子；辅助质粒pMON7124含有tnsABCD区（tnsABCD region supplies thetransposition proteins required for insertion of themini-Tn7 from the donor plasmid into its target site onthe parent bacmid），具有四环素抗性，在细胞扩增过程中丢失，但可提高供体质粒pFastBac转化后的基因转座效率。mcrA、mcrBC及mrr突变使DH10Bac菌株适合于克隆富含甲基胞嘧啶或甲基腺嘌呤的DNA（Therefore , genomic DNA ,both prokaryotic and eukaryotic, can be clonedefficiently in DH10Bac）。recA1和endA1的突变有利于插入DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。φ80dlacZ∆M15的存在使DH10Bac可用于蓝白斑筛选，High5TM系列DH10Bac感受态细胞经特殊工艺制作，经pUC19质粒检测转化效率>108cfu/μg。

操作说明：

1.DH10Bac感受态细胞放置冰中融化（或放手心或室温片刻，待菌体处于冰水混合状态时迅速插入冰中），加入目的DNA（质粒或连接产物）并用手打EP管底轻轻混匀，冰上静置25分钟。 

2.42℃水浴热激45秒，迅速放回冰上并静置2分钟，晃动会降低转化效率。 

3.向离心管中加入900μl不含抗生素的SOC无菌培养液，混匀后37℃，225 rpm复苏4小时。4.复苏完成后，用S.O.C.稀释转化液到（10-1，10-2），每个稀释用吸取100ul铺一个LB平板（共涂3个平板），平板包含50ug/ml Kan，7ug/ml Gentamicin，10ug/ml tetracycline，40ug/ml X-gal，40ug/ml IPTG。5.将平板倒置放于37℃培养箱48h。

 阳性验证： 

1.挑10个白色的克隆，重新划线在LB平板（50ug/ml Kan，7ug/ml Gentamicin，10ug/ml tetracycline，40ug/ml X-gal，40ug/ml IPTG）。37度过夜培养。 

2.挑选白色的克隆，转接到含有50ug/ml Kan，7ug/mlGentamicin，7ug/ml tetracycline的LB培养液中，过夜培养。 

3.使用试剂盒抽提重组质粒DNA（＞100kb）。使用PCR法分析重组质粒是否正确重组。

注意事项：

1. 感受态细胞最好在冰上融化。 

2.混入质粒或连接产物时应轻柔操作。 

3.转化高浓度的质粒或高效率的连接产物可相应减少最终用于涂板的菌量。 

4. 涂板时务必涂干，平板表面不留任何水渍。