Chemically Competent Cell克隆感受态细胞

SURE Chemically Competent Cell

基因型：

E.coli B e14-(McrA-) Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)171 endA1gyrA96 thi-1 supE44 relA1 lac recB recJ sbcC umuC::Tn5(Kanr) uvrC [F´ proAB lacIqZΔM15 Tn10 (TetR)].

简要说明：

真核生物DNA存在较多“十字型"、“Z字型"等二级或三级结构，这种DNA结构在利用传统大肠杆菌进行克隆时易被大肠杆菌体内的重组酶系统或其他防御系统识别并对其进行重组，删除等破坏，导致很难对这类DNA进行正确的克隆操作。SURE菌株可以解决这些问题：此菌株体内重组酶系统整条通路被破坏，并且(McrA-, McrCB-, McrF-, Mrr-, HsdR-) 这些限制性突变的存在赋予此菌株无法对外源DNA进行标记、限制的能力，提高了外源甲基化DNA的克隆效率，同时具有核酸酶(endA)突变、重组酶 (recB recJ)突变，增强了外源DNA的稳定性。存在于F´因子上的lacIqZΔM15基因使此菌株可以进行蓝白斑筛选；Kanr，Tetr赋予菌株KA那霉素和四环素抗性。High5TM系列SURE感受态细胞由特殊工艺制作，经pUC19质粒检测转化效率达5×108cfu/μg。

操作说明：

1.SURE感受态细胞放置冰中融化，加入目的DNA（质粒或连接产物）并用手轻轻打EP管底轻轻混匀，冰上静置25分钟。

2.42℃水浴热激45秒，迅速放回冰上并静置2分钟，晃动会降低转化效率。

3.向离心管中加入700μl不含抗生素的2YT或LB无菌培养基，混匀后37℃，200rpm复苏60分钟。

4.5000rpm离心一分钟收菌，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的2YT或LB培养基上。

5.将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。

注意事项：

1.感受态细胞最好在冰上融化。

2.混入质粒或连接产物时应轻柔操作。

3.操作过程中勿将感受态暴露于氧化性环境中，例如超净台应将臭氧排净后再使用。

4.转化高浓度的质粒或高效率的连接产物可相应减少最终用于涂板的菌量。

5. 此菌株具有KA 那霉素，四环素抗性，拥有这两种抗性的质粒无法使用；对<40 µg/mlLU霉素有抗性，但对100µg/mlLU霉素敏感。使用其他抗生素参考浓度：氨苄QIN霉素（终浓度： 100 µg/ml），LU霉素（终浓度：100 µg/ml）。

6.High5TM系列SURE感受态细胞采用常规转化方法，转化效率可达5×108cfu/μg。 ；如果有更高要求，可尝试Stratagene公司推荐的标准protocol。