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Cassification
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详细介绍
品牌 | Abnbio | 货号 | ABG703-50 |
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规格 | 50支100ul | 供货周期 | 现货 |
主要用途 | 细胞培养 | 应用领域 | 化工,生物产业,制药 |
Y187 Chemically Competent Cell 酵母感受态细胞
基因型:
MATα, ura3-52, his3-200, ade 2-101, trp 1-901, leu 2-3,112, gal4Δ, met–, gal80Δ, URA3 : : GAL1UAS-GAL1TATAlacZ, MEL1
简要说明:
Y187菌株是GAL4系统酵母单杂,双杂实验用菌株,MATα型,可直接转化质粒或与MATa型酵母菌株 (Y2HGold,AH109等)通过mating操作进行筛库试验。Transformation marker为: trp1,leu2,报告基因为:lacZ,MEL1。Y187有两个报告基因:lacZ,MEL1,分别由两种不同的启动子 (G1,M1)启动,这两种启动子只有GAL4识别的17bp核心区相同,其余部分均不同,大大降低了酵母双杂假阳性发生的概率。Y187感受态细胞经特殊工艺制作,pGADT7质粒检测转化效率>104 cfu/μg DNA。
操作说明:
1. 取pBait-AbAi质粒5µg,BstBI或 BbsI酶切1h,回收;
2. 取一支无菌的1.5ml EP管,依次加入预冷的预冷的线性pBait-AbAi质粒1-5 µg(体积不高于15 µl),Carrier DNA(95-100 度5min 快速冰浴,重复一次)10µl,100µl冰上融化的Y1HGold感受态细胞,PEG/LiAc 500µl,轻轻翻转混匀6-8次;
3. 30℃水浴30min,每10min轻轻翻转混匀6-8次;
4. 每支加入20µl的二甲基亚砜(用以提高转化效率,可不做);
5. 42℃水浴15min,每5min轻轻翻转混匀6-8次;
6. 12000rpm瞬时离心弃上清,每支加入1ml的YPD Plus(YPDA)于30℃复苏1h(用以提高转化效率,可不做);
7. 12000rpm瞬时离心弃上清,用100µl 0.9% NaCl重悬,涂板,30℃培养48-96h。
注意事项:
1.PEG在低温下易析出,请在常温下wan全溶解后使用。
2.转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
3.同时转化2-3种质粒时可增加质粒的用量。
4.Y1HGold酵母菌株对高温敏感,最适生长温度为27-30℃;高于31℃,生长速度和转化效率呈指数下降。
5.菌落变粉不是污染,是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后,平板上的Adenine被酵母消耗完毕,酵母试图通过自身代谢途径合成Adenine以供利用,然而,Y1HGold的ADE2基因被破坏,Adenine合成途径受阻;又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常,所以造成中间产物P-ribosylaminoimidazole(AIR)在细胞中积累而使菌落变为粉红色。
6.酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢,培养基中缺陷成分越多,生长越慢,以转化涂板为例:涂YPDA平板29℃,48h培养可见直径1mm克隆;涂SD单缺平板29℃,48-60h培养可见直径1mm克隆,涂SD双缺平板29℃,60-80h培养可见直径1mm克隆,涂SD三缺或四缺平板平板29℃,80-90h培养可见直径1mm克隆。
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