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Cassification
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详细介绍
品牌 | Abnbio | 货号 | ABG702-50 |
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规格 | 50支100ul | 供货周期 | 现货 |
主要用途 | 细胞培养 | 应用领域 | 化工,生物产业,制药 |
AH109 Chemically Competent Cell 酵母感受态细胞
基因型:
MATa, trp1-901, leu2-3, 112, ura3-52, his3-200, gal4Δ,gal80Δ,LYS2 : : GAL1UAS-GAL1TATA-HIS3, MEL1 GAL2UASGAL2TATA-ADE2, URA3::MEL1UAS-MEL1TATA-lac
简要说明:
AH109菌株来源于PJ69-2A 酵母菌株,将lacZ报告基因引入PJ69-2A诞生了AH109,此菌株是Clontech公司开发的GAL4系统酵母双杂实验用菌株,MATa型,可直接转化质粒或与MATα型酵母菌株Y187通过mating操作进行蛋白互作验证或筛库试验。Transformation marker为: trp1, leu2,报告基因为:lacZ,HIS3, ADE2, MEL1。AH109 -GAL4酵母双杂系统需要两种质粒配套使用:PGBKT7和PGADT7。质粒PGBKT7的筛选标志为TRP1,用于表达DNA-BD(来自酵母转录因子GAL4N端1~ 174位氨基酸)与目标蛋白(Bait)的融合蛋白;质粒PGADT7的筛选标志为LEU,用于表达AD(GAL4 C端768 ~881 位氨基酸)与目标蛋白(Prey)的融合蛋白。GAL4系统原理:一个完整的酵母转录因子GAL4可分为功能上相互独立的两个结构域:位于N端1 ~ 174位氨基酸区段的DNA结合域(DNA-BD)和位于C端768 ~881 位氨基酸区段的转录激活域(AD)。DNA-BD能够识别GAL4-responsive gene的上游激活序列UAS,并与之结合。而AD可以启动UAS下游的基因进行转录。BD和AD单独存在不能激活转录,但当二者接近时,则呈现完整的GAL4活性,使含有UAS的启动子下游基因转录表达。正常条件下,BD不与AD结合,将要检测的蛋白质分别与BD和AD融合,形成 bait 融合蛋白(bait -BD)和 prey 融合蛋白(prey-AD),如果 bait 和 prey发生相互作用,就会促使 BD 和 AD 的相互接近,形成完整的GAL4,从而激活报告基因的转录。AH109有四个报告基因:lacZ, HIS3, ADE2, MEL1,分别由三种不同的启动子(GAL1,GAL2,MEL1)启动,这三种启动子只有GAL4识别的17bp核心区相同,其余部分均不同,大大降低了酵母双杂假阳性发生的概率。 High5TM系列AH109感受态细胞经特殊工艺制作,经PGADT7质粒检测转化效率>104cfu/μg DNA 。
操作说明:
1. 取pBait-AbAi质粒5µg,BstBI或 BbsI酶切1h,回收;
2. 取一支无菌的1.5ml EP管,依次加入预冷的预冷的线性pBait-AbAi质粒1-5 µg(体积不高于15 µl),Carrier DNA(95-100 度5min 快速冰浴,重复一次)10µl,100µl冰上融化的Y1HGold感受态细胞,PEG/LiAc 500µl,轻轻翻转混匀6-8次;
3. 30℃水浴30min,每10min轻轻翻转混匀6-8次;
4. 每支加入20µl的二甲基亚砜(用以提高转化效率,可不做);
5. 42℃水浴15min,每5min轻轻翻转混匀6-8次;
6. 12000rpm瞬时离心弃上清,每支加入1ml的YPD Plus(YPDA)于30℃复苏1h(用以提高转化效率,可不做);
7. 12000rpm瞬时离心弃上清,用100µl 0.9% NaCl重悬,涂板,30℃培养48-96h。
注意事项:
1.PEG在低温下易析出,请在常温下wan全溶解后使用。
2.转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
3.同时转化2-3种质粒时可增加质粒的用量。
4.Y1HGold酵母菌株对高温敏感,最适生长温度为27-30℃;高于31℃,生长速度和转化效率呈指数下降。
5.菌落变粉不是污染,是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后,平板上的Adenine被酵母消耗完毕,酵母试图通过自身代谢途径合成Adenine以供利用,然而,Y1HGold的ADE2基因被破坏,Adenine合成途径受阻;又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常,所以造成中间产物P-ribosylaminoimidazole(AIR)在细胞中积累而使菌落变为粉红色。
6.酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢,培养基中缺陷成分越多,生长越慢,以转化涂板为例:涂YPDA平板29℃,48h培养可见直径1mm克隆;涂SD单缺平板29℃,48-60h培养可见直径1mm克隆,涂SD双缺平板29℃,60-80h培养可见直径1mm克隆,涂SD三缺或四缺平板平板29℃,80-90h培养可见直径1mm克隆。
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