M15(pREP4) 感受态细胞

基因型

F-, Φ80ΔlacM15, thi, lac-, mtl-, recA+,KmR

简要说明

M15(pREP4)蛋白表达菌株含有pREP4质粒，该质粒通过p15A复制子启动复制，可以与许多原核表达质粒共存于同一大肠杆菌细胞中；同时该质粒携带lac I基因，可高效表达lac抑制蛋白，在IPTG诱导前可抑制目标蛋白的本底表达，特别适合毒性基因的表达。M15(pREP4)菌株是PQE系列质粒的配套菌株，特别适合PQE系列质粒或由E.coli T5 启动子诱导表达的质粒的蛋白表达。pREP4质粒赋予该菌株ka那霉素抗性。M15(pREP4)感受态细胞经特殊工艺制作，pUC19质粒检测转化效率达2×108cfu/μg DNA。

操作说明

1、M15(pREP4)感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入目的质粒并用手拨EP管底混匀，冰中静置25分钟。 

2. 42℃水浴热激45秒，迅速放回冰上并静置2分钟，晃动会降低转化效率。 

3. 向离心管中加入700 μl不含抗生素的无菌培养基(LB)，混匀后37℃，200 rpm复苏60分钟。

4. 5000 rpm离心一分钟收菌，留取50 μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的LB培养基上（若质粒浓度较高，也可稀释后涂板，务必保证能在平板上挑到单克隆菌落）。

5. 将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养，M15(pREP4)菌株在平板或液体培养基中生长时，需在培养基中加入终浓度为35ug/ml的ka那霉素。

注意事项

1、感受态细胞最好在冰中缓慢融化，插入冰中8分钟内加入目标DNA，不可在冰中放置时间过长，长时间存放会降低转化效率。

2. M15(pREP4)菌株在平板或液体培养基中生长时，需在培养基中加入终浓度为35ug/ml的ka那霉素。

3. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。

4. 为获得需要量的蛋白，最佳诱导时间，温度，IPTG浓度需实验者优化。