Rosetta-gami B(DE3) 感受态细胞

基因型

F- ompT hsdSB(rB-mB-) gal dcm lacY1 ahpC(DE3)gor522::Tn10 trxB pRARE (Camr, Kanr, Tetr)

简要说明

Rosetta-gami B(DE3) 菌株聚合了BL21，Tuner，Origami和Rosetta 四种菌株的优点： lacY1基因 (半乳糖苷透性酶基因)突变赋予其Tuner菌株的优点——IPTG以均一速度进入体系中大肠杆菌的每个细胞，产生更加严格、均一的浓度依赖。 pRARE赋予其Rosetta菌株的优点——补充大肠杆菌缺乏的6种稀有密码子(AUA, AGG,AGA, CUA,CCC,GGA)对应的tRNA，提高外源基因的表达水平。 gor522::Tn10 trxB赋予其Origami菌株的优点——突变的硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase) (trxB)和谷guang甘肽还原酶(glutathione reductase) (gor)基因，它们是还原途径的两个关键酶，其突变有利于高效形成正确折叠的含有二硫键的蛋白，增强蛋白的可溶性。该菌株染色体整合了λ噬菌体DE3 区(DE3区含有T7噬菌体RNA 聚合酶)适合T7 启动子诱导的蛋白表达。＊ Rosetta-gamiB(DE3)菌株具有卡na霉素，lu霉素，四环素抗性，由特殊工艺制作，经pUC19质粒检测转化效率高达108 cfu/μg DNA。

操作说明

1、Rosetta-gami B(DE3)菌株感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入目的DNA并用手拨EP管底轻轻混匀(避免用枪吸打)，冰中静置25分钟。

2.42℃水浴热激45秒，迅速放回冰上并静置2分钟，晃动会降低转化效率。 

3.向离心管中加入700 μl不含抗生素的无菌2YT或LB培养基，混匀后37℃，200 rpm复苏60分钟。

4.5000 rpm离心一分钟收菌，留取100 μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含所选质粒筛选抗生素的2YT或LB培养基上。

5.将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。

注意事项

1、感受态细胞最好在冰中缓慢融化，插入冰中8分钟内加入目标DNA，不可在冰中放置时间过长，长时间存放会降低转化效率。

2.混入质粒时应轻柔操作。

3.转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。

4.诱导时，IPTG浓度可选（0.1-2 mM均可）。

5.为获得需要量的蛋白，最佳诱导时间，温度，IPTG浓度需实验者优化。