Electroporation克隆 (电击) 感受态细胞

GT115 Electroporation-Competent Cell 克隆 (电击) 感受态细胞

基因型：

F- mcrA∆(mrr-hsdRMS-mcrBC) f80lacZDM15∆lacX74 recA1rpsL (StrR) endA1 ∆dcm uidA(DMluI)::pir-116∆sbcC-sbcD

简要说明：

GT115菌株，是专门用来克隆含有发夹结构（Hairpin）或重复序列等DNA二级结构的基因序列的大肠杆菌菌株。大肠杆菌中存在一种SbcCD蛋白复合体，可以识别DNA发夹结构，并将其切除；将sbcC和sbcD两个基因突变，增强了发夹结构DNA的稳定性。同时在大肠杆菌基因组中引入uidA(DMluI)::pir-116，使GT115可以表达 兀 蛋白，含有R6Kgori复制子的质粒( pCpG-mcs、pCpG-LacZ、pCpG-siRNA …)可以正常复制。rpsL赋予GT115lian霉素抗性，同时该菌株还含有核酸酶 (endA)突变、重组酶 (recA)突变，增强了外源DNA的稳定性。GT115电击感受态细胞经特殊工艺制作，pUC19质粒检测转化效率可达1×1010 cfu/μg DNA。

操作说明：

一、0.1cm 电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上 5分钟，待其沥干水分，正置 5分钟，使乙醇充分挥发，待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电极杯顶离冰面 0.5cm以方便盖上杯盖，冰中静置 5分钟充分降温。

二、取-80℃保存的TOP-10电击感受态细胞插入冰中5 分钟，待其融化，加入目的 DNA (质粒或连接产物)并用手bo打EP 管底轻轻混匀，避免产生气泡，立即插入冰中。A. 测定转化效率使用 1 μl 10 pg/μl 的对照质粒 pUC19；  B. 对于连接产物，请用乙醇沉淀DNA 后加入适量 TE缓冲液(10mM TrisHCl, pH7.5;1mM EDTA)重悬，DNA 浓度不超过100ng/μl，体积不超过 5μl/50μl 感受态。

三、用200 μl枪头将感受态-DNA 混合物快速移到电击杯中，避免产生气泡，盖上杯盖。

四、启动电转仪，设置参数：C=25 μF，PC=200 Ω，V=1.8kV(此为 BioRad 电转仪推荐参数，也可按所用电转仪推荐的参数操作），将电击杯快速放入电转槽中，电击完成快速插入冰中。

五、2分钟后从冰中取出电击杯，放室温，加入 700 μl不含抗生素的无菌 S.O.C. 培养基（室温），用1ml 枪吹吸电击杯底部数次混匀后，转移到 50ml 离心管（BD Falcon50ml锥形离心管等），向离心管中补加S.O.C. 培养基至 5ml。37℃，225rpm 复苏60 分钟。

六、5000rpm离心一分钟收菌，重悬后取 100-200 μl涂布到含相应抗生素的S.O.C 平板上（因菌量较大，若全部涂板请选用直径 15cm培养皿2-5 个）。将平板倒置放于 37℃培养箱过夜培养13-17 小时。

注意事项：

（一）加入DNA 时体积不应大于感受态体积的1/10。

（二）电击感受态细胞加入电击杯应避免产生气泡，气泡会增加弧光放电风险。

（三）当DNA 不纯或存在盐，乙醇，蛋白及缓冲液等污染时，转化效率急剧下降。

（四）电击杯里的离子可增加溶液的电导，增大在含有细胞和DNA 的溶液中产生电流和弧光放电的风险。

（五）若转化大质粒或想获得较高转化效率，推荐使用高纯质粒提取试剂盒提取质粒。质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。

（六）对于连接产物转化， 最好转化前乙醇沉淀DNA后用适量TE缓冲液 (10 mMTrisHCl,pH7.5;1 mMEDTA)重悬产物，保证DNA 浓度不超过 100ng/μl。过高浓度连接产物或过大体积连接产物会降低转化效率，增加弧光放电的风险。

（七）混入质粒时应轻柔操作，吸取感受态细胞时不可用孔径过小的枪头 (普通 200ul 枪头应剪去枪头尖0.6cm)避免用力过猛，以免剪切力过大损伤细胞膜，降低转化效率。转化高浓度的质粒或连接产物可相应减少最终用于涂板的菌量。

（八）电击感受态细胞最好保存在-80℃以下，高于-80℃超期储存会导致转化效率会下降。