Chemically Competent Cell克隆感受态细胞

EPI300 Chemically Competent Cell

基因型：

F – mcrA ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80dlacZ∆M15∆lacX74 recA1 endA1 araD139 ∆(ara,leu)7697 galU galK λ–rpsL nupG trfA dhfr。

简要说明：

EPI300细胞含有一个突变的trfA基因，该基因表达出的蛋白产物可以促进含有ori V复制子的质粒的高拷贝扩繁，诱导剂Ⅰ可以诱导trfA基因的表达。当含有ori V复制子质粒的EPI300细胞在LB/2YT或SOB培养基中生长时，trfA基因的表达被抑制，ori V复制子质粒的拷贝数维持在很低的水平；当在培养基中加入诱导剂Ⅰ，ori V复制子质粒的拷贝数可维持在很高的水平，提高了质粒产量。因此EPI300菌株可以降低ori V复制子质粒的拷贝数，特别适合于各种不稳定 DNA 或毒性基因的克隆。 [mrr-hsdRMS-mcrBC]基因型使EPI300菌株适合于克隆富含甲基胞嘧啶或甲基腺嘌呤的DNA（例如：哺乳动物基因组DNA）。

recA1和endA1的突变有利于插入DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。lacZΔM15 标记的存在使EPI300可用于蓝白斑筛选，rpsL赋予其lian霉素抗性。EPI300感受态细胞经特殊工艺制作，pUC19质粒检测转化效率可达3×108cfu/μg DNA

操作说明：

1.EPI300感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入目的DNA（质粒或连接产物）并用手bo打EP管底混匀，冰中静置25分钟。 

2.42℃水浴热激45秒，迅速放回冰上并静置2分钟，晃动会降低转化效率。 

3.向离心管中加入700 μl不含抗生素的无菌2YT或LB培养基，混匀后37℃，200 rpm复苏60分钟。

4.5000 rpm离心一分钟收菌，留取100 μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的2YT或LB培养基上。 

5.将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。如果进行蓝白斑筛选操作，将平板放37℃培养至少15 h。

注意事项：

1.感受态细胞最好在冰中缓慢融化。插入冰中8分钟内加入目标DNA，不可在冰中放置时间过长，长时间存放会降低转化效率。 

2.混入目的DNA时，应轻柔操作。