Chemically 酵母感受态细胞

Y1HGold Chemically Competent Cell  酵母感受态细胞

基因型：

MATα, ura3-52, his3-200, ade2-101, trp1-901, leu2-3,112, gal4Δ, gal80Δ, met–, MEL1

简要说明：

Y1HGold菌株是GAL4-AbA酵母单杂系统用菌株，MATα型，可直接转化质粒进行筛库试验。Transformation marker为：ura3，leu2；报告基因为：AbAr。Y1HGold-GAL4-AbA 酵母单杂系统需要两种质粒配套使用：pAbAi 和PGADT7。质粒pAbAi的筛选标志为URA，用于表达pBait-AbAi construct (1~3个bait DNA序列重复串联后克隆到pAbAi中)；质粒pGADT7的筛选标志为LEU，用于表达AD(GAL4 C端768~881位氨基酸)与目标蛋白 (Prey)的融合蛋白。此外AbAr与营养缺陷报告基因相比具有更低背景的优点，可降低酵母单杂假阳性发生的概率。Y1HGold感受态细胞经特殊工艺制作，pGADT7质粒检测转化效率>104 cfu/μg DNA。

操作说明：

1. 取pBait-AbAi质粒5µg，BstBI或 BbsI酶切1h，回收； 

2. 取一支无菌的1.5ml EP管，依次加入预冷的预冷的线性pBait-AbAi质粒1-5 µg（体积不高于15 µl），Carrier DNA(95-100 度5min 快速冰浴，重复一次)10µl，100µl冰上融化的Y1HGold感受态细胞，PEG/LiAc 500µl，轻轻翻转混匀6-8次； 

3. 30℃水浴30min，每10min轻轻翻转混匀6-8次； 

4. 每支加入20µl的二甲基亚砜（用以提高转化效率，可不做）； 

5. 42℃水浴15min，每5min轻轻翻转混匀6-8次； 

6. 12000rpm瞬时离心弃上清，每支加入1ml的YPD Plus（YPDA）于30℃复苏1h（用以提高转化效率，可不做）； 

7. 12000rpm瞬时离心弃上清，用100µl 0.9% NaCl重悬，涂板，30℃培养48-96h。

注意事项：

1.PEG在低温下易析出，请在常温下wan全溶解后使用。 

2.转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。

 3.同时转化2-3种质粒时可增加质粒的用量。 

4.Y1HGold酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率呈指数下降。 

5.菌落变粉不是污染，是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后，平板上的Adenine被酵母消耗完毕，酵母试图通过自身代谢途径合成Adenine以供利用，然而，Y1HGold的ADE2基因被破坏，Adenine合成途径受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中间产物P-ribosylaminoimidazole（AIR）在细胞中积累而使菌落变为粉红色。 

6.酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢，以转化涂板为例：涂YPDA平板29℃，48h培养可见直径1mm克隆；涂SD单缺平板29℃，48-60h培养可见直径1mm克隆，涂SD双缺平板29℃，60-80h培养可见直径1mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90h培养可见直径1mm克隆。