Rosetta 2(DE3) 感受态细胞

基因型

F-ompT hsdSB(rB-mB-)gal dcm(DE3) pRARE(argU，argW，ileX，glyT，leuW，proL)(CamR)

简要说明

Rosetta(DE3) 感受态细胞具有lu霉素抗性，补充大肠杆菌缺乏的6 种稀有密码子(AUA，AGG， AGA， CUA，CCC，GGA) 对应的tRNA，提高外源基因，尤其是真核基因在原核系统中的表达水平，该菌株染色体整合了λ噬菌体DE3区（DE3区含有T7噬菌体RNA聚合酶），同时表达T7RNA聚合酶和大肠杆菌RNA聚合酶，可用于pET系列，pGEX，pMAL等质粒的蛋白表达。Rosetta(DE3)感受态细胞由特殊工艺制作，经pUC19质粒检测转化效率高达108cfu/μg。

操作说明

1、Rosetta 2(DE3)感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入目的质粒并用手拨EP管底轻轻混匀(避免用枪吸打)，冰中静置25分钟。

2. 42℃水浴热激45秒，迅速放回冰中并静置2分钟，晃动会降低转化效率。 

3. 向离心管中加入700 μl不含抗生素的LB无菌培养液，37℃，200 rpm复苏60分钟。

 4. 5000 rpm离心一分钟收菌，留取50 μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的LB培养基上。

5. 将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。

注意事项

1、感受态细胞最好在冰中缓慢融化，插入冰中8分钟内加入目标DNA，不可在冰中放置时间过长，长时间存放会降低转化效率。

2. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。

3. 诱导时，IPTG浓度可选（0.1-10 mM均可）。

4. 为获得需要量的蛋白，最佳诱导时间，温度，IPTG浓度需实验者优化。

 5. Rosetta 2(DE3) 菌株携带pRARE2质粒，除复苏培养基为无抗生素外，其余所用培养基、培养液均应含有34µg/mllu霉素，以防质粒丢失。