Electroporation克隆 (电击) 感受态细胞

SURE Electroporation-Competent Cell 克隆 (电击) 感受态细胞

基因型：

E. coli B e14-(mcrA-) Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)171 endA1gyrA96 thi-1 supE44 relA1 lac recB recJ sbcCumuC::Tn5(Kanr) uvrC [F´ proAB lacIqZΔM15 Tn10 (TetR)]

简要说明：

SURE 电击感受态细胞只能用于电击转化，不能用于热激转化。真核生物 DNA 存在较多“十字型"、“Z字型"等二级或三级结构，这种 DNA 结构在利用传统大肠杆菌进行克隆时易被大肠杆菌体内的重组酶系统或其他防御系统识别并对其进行重组，删除等破坏，导致很难对这类 DNA 进行正确的克隆操作。SURE菌株可以解决这些问题：此菌株体内重组酶系统整条通路被破坏，并且 (mcrA-,mcrCB-, mcrF-, mrr-,hsdR-)这些限制性突变的存在赋予此菌株无法对外源DNA 进行标记、限制，提高了外源甲基化DNA 的克隆效率，同时具有核酸酶 (endA)突变、重组酶 (recB recJ)突变，增强了外源 DNA 的稳定性。存在于F´ 因子上的 lacIqZΔM15 基因使此菌株可以进行蓝白斑筛选；KanR，TetR赋予菌株ka那mei素和四环素抗性。SURE电击感受态细胞经特殊工艺制作，pUC19质粒检测转化效率>0.5×1010 cfu/μg DNA。

操作说明：

一、0.1cm 电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上 5分钟，待其沥干水分，正置 5分钟，使乙醇充分挥发，待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电极杯顶离冰面 0.5cm以方便盖上杯盖，冰中静置 5分钟充分降温。

二、取-80℃保存的TOP-10电击感受态细胞插入冰中5 分钟，待其融化，加入目的 DNA (质粒或连接产物)并用手bo打EP 管底轻轻混匀，避免产生气泡，立即插入冰中。A. 测定转化效率使用 1 μl 10 pg/μl 的对照质粒 pUC19；  B. 对于连接产物，请用乙醇沉淀DNA 后加入适量 TE缓冲液(10mM TrisHCl, pH7.5;1mM EDTA)重悬，DNA 浓度不超过100ng/μl，体积不超过 5μl/50μl 感受态。

三、用200 μl枪头将感受态-DNA 混合物快速移到电击杯中，避免产生气泡，盖上杯盖。

四、启动电转仪，设置参数：C=25 μF，PC=200 Ω，V=1.8kV(此为 BioRad 电转仪推荐参数，也可按所用电转仪推荐的参数操作），将电击杯快速放入电转槽中，电击完成快速插入冰中。

五、2分钟后从冰中取出电击杯，放室温，加入 700 μl不含抗生素的无菌 S.O.C. 培养基（室温），用1ml 枪吹吸电击杯底部数次混匀后，转移到 50ml 离心管（BD Falcon50ml锥形离心管等），向离心管中补加S.O.C. 培养基至 5ml。37℃，225rpm 复苏60 分钟。

六、5000rpm离心一分钟收菌，重悬后取 100-200 μl涂布到含相应抗生素的S.O.C 平板上（因菌量较大，若全部涂板请选用直径 15cm培养皿2-5 个）。将平板倒置放于 37℃培养箱过夜培养13-17 小时。

注意事项：

（一）加入DNA 时体积不应大于感受态体积的1/10。

（二）电击感受态细胞加入电击杯应避免产生气泡，气泡会增加弧光放电风险。

（三）当DNA 不纯或存在盐，乙醇，蛋白及缓冲液等污染时，转化效率急剧下降。

（四）电击杯里的离子可增加溶液的电导，增大在含有细胞和DNA 的溶液中产生电流和弧光放电的风险。

（五）若转化大质粒或想获得较高转化效率，推荐使用高纯质粒提取试剂盒提取质粒。质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。

（六）对于连接产物转化， 最好转化前乙醇沉淀DNA后用适量TE缓冲液 (10 mMTrisHCl,pH7.5;1 mMEDTA)重悬产物，保证DNA 浓度不超过 100ng/μl。过高浓度连接产物或过大体积连接产物会降低转化效率，增加弧光放电的风险。

（七）混入质粒时应轻柔操作，吸取感受态细胞时不可用孔径过小的枪头 (普通 200ul 枪头应剪去枪头尖0.6cm)避免用力过猛，以免剪切力过大损伤细胞膜，降低转化效率。转化高浓度的质粒或连接产物可相应减少最终用于涂板的菌量。

（八）电击感受态细胞最好保存在-80℃以下，高于-80℃超期储存会导致转化效率会下降。