Chemically Competent Cell克隆感受态细胞

GT115 Chemically Competent Cell

基因型：

F- mcrA∆(mrr-hsdRMS-mcrBC) f80lacZDM15∆lacX74 recA1rpsL (StrR) endA1 ∆dcm uidA(DMluI)::pir-116∆sbcC-sbcD

简要说明：

GT115菌株，是专门用来克隆含有发夹结构（Hairpin）或重复序列等DNA二级结构的基因序列的大肠杆菌菌株。大肠杆菌中存在一种SbcCD蛋白复合体，可以识别DNA发夹结构，并将其切除；将sbcC和sbcD两个基因突变，增强了发夹结构DNA的稳定性。同时在大肠杆菌基因组中引入uidA(DMluI)::pir-116，使GT115可以表达 兀 蛋白，含有R6Kgori复制子的质粒( pCpG-mcs、pCpG-LacZ、pCpG-siRNA …)可以正常复制。rpsL赋予GT115lian霉素抗性，同时该菌株还含有核酸酶 (endA)突变、重组酶 (recA)突变，增强了外源DNA的稳定性。GT115感受态细胞经特殊工艺制作，pUC19质粒检测转化效率可达1×108 cfu/μg DNA。

操作说明：

1. 感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，待菌块融化，加入目的 DNA（质粒或连接产物） 并用手bo打 EP管底轻轻混匀(避免用枪吸打)，冰中静置25 分钟。

2. 42℃水浴热激 45秒，迅速放回冰上并静置 2分钟，晃动会降低转化效率。

3. 向离心管中加入700 μl不含抗生素的无菌SOC 或LB培养基，混匀后 37℃，200 rpm复苏 60分钟。 

4. 5000 rpm离心一分钟收菌，留取 100 μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的 SOC 或 LB培养基上。

5. 将平板倒置放于37℃培养 6.5 小时以上

注意事项：

1. 感受态细胞最好在冰中缓慢融化。插入冰中8 分钟内加入目标DNA，不可在冰中放置时间过长，长时间存放会降低转化效率。

2. 混入目的 DNA 时应轻柔操作。 

3. 转化高浓度的质粒或高效率的连接产物可相应减少最终用于涂板的菌量。