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酵母感受态细胞的操作说明及注意事项

更新时间:2024-11-12      点击次数:185
质粒pYES2的筛选标志为URA,可用SD-URA板板进行筛选。BY4742感受态细胞经特殊工艺制作,pYES2质粒检测转化效率>104cfu/μg DNA。
操作说明:
1、取一支无菌的1.5mlEP管,依次加入预冷的目的质粒1-3µg,Carrier DNA 10µl(95-100 度5min 快速冰浴,重复一次),100µl冰上融化的AH109感受态细胞,PEG/LiAc500µl,轻轻翻转混匀6-8次; 
2、30℃水浴30min,每10min轻轻翻转混匀6-8次;
3、每支加入20µl的二甲基亚砜;(用于提高转化效率,可不做)
4、42℃水浴15min,每5min轻轻翻转混匀6-8次;
5、12000rpm瞬时离心弃上清,每支加入1ml的YPDPlus于30℃复苏1h;(用于提高转化效率,可不做)
6、12000rpm瞬时离心弃上清,用100µl0.9%NaCl重悬,涂板,30℃培养48-96h。
注意事项:
1、感受态细胞最好在冰上融化。
2、若使用pYES2质粒表达蛋白,需在培养基中加入2%的半乳糖(筛选培养基中不用加半乳糖;当需要目的蛋白表达时,需加入半乳糖代替葡萄糖作为碳源),以诱导目的基因的表达。
3、转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
4、同时转化2-3种质粒时可增加质粒的用量。
5、酵母为真核生物,不易长期保存,随感受态在-80℃保存时间的延长,转化效率会不断下降,建议保存时间不超过90天。
6、BY4742酵母菌株对高温敏感,适生长温度为27-30℃;高于31℃,生长速度和转化效率呈指数下降。
7、酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢,培养基中缺陷成分越多,生长越慢,以转化涂板为例:涂YPDA平板29℃,48h培养可见直径1mm克隆;涂SD单缺平板29℃,48-60h培养可见直径1mm克隆,涂SD双缺平板29℃,60-80h培养可见直径1mm克隆,涂SD三缺或四缺平板平板29℃,80-90h培养可见直径1mm克隆。
 

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