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克隆感受态细胞在操作时有哪些注意事项

更新时间:2024-03-20      点击次数:359
Mach1-T1菌株由野生型non-K-12 E. Coli W菌株改造而来,是目前生长速度较快的感受态细胞之一,在平板上9h可见克隆,缺失核酸内切酶 (endA),提高了质粒DNA的产量和质量;重组酶缺陷型 (recA1398)减少插入片段的同源重组概率,保证了插入DNA的稳定性;lacZ M15的存在使Mach1-T1可用于蓝、白斑筛选;tonA突变赋予Mach1-T1菌株对噬菌体T1和T5的抗性。Mach1-T1感受态细胞经特殊工艺制作,pUC19质粒检测转化效率>5x108 cfu/μg DNA。
注意事项:
1、感受态细胞建议在冰中缓慢融化。插入冰中8分钟内加入目标DNA,不可在冰中放置时间过长,长时间存放会降低转化效率。
2、混入目的DNA时应轻柔操作。
3、转化高浓度的质粒或高效率的连接产物可相应减少最终用于涂板的菌量。
操作说明:
1.Mach1-T1感受态细胞从-80℃拿出,迅速插入冰中,待菌块融化,加入目的 DNA(质粒或连接产物)并用手打EP管底轻轻混匀(避免用枪吸打),冰中静置 25分钟。
2.42℃水浴热激45秒,迅速放回冰上并静置2分钟,晃动会降低转化效率。
3.向离心管中加入700μl不含抗生素的无菌2YT或LB培养基,混匀后37℃,200rpm复苏60分钟。
4.5000rpm离心一分钟收菌,留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的2YT或LB培养基上。
5.将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。如果进行蓝白斑筛选操作,将平板放37℃至少至少13h。

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